To år er gået, og den blide Peter Parker (Tobey Maguire) står overfor nye udfordringer med sin "gave og forbandelse," mens han kæmper med at håndtere sin dobbelte identitet som både den spindelvævsslyngende superhelt Spider-Man og livet som universitetsstuderende. En tynget Peter indser, at hans hemmeligheder truer hans forhold til alle dem, han holder af. Hans livslange længsel efter MJ (Kirsten Dunst) bliver kun stærkere, mens han kæmper imod at ville afsløre sit hemmelige liv og erklære hende sin kærlighed. Hans venskab med Harry Osborn (James Franco) kompliceres af den unge Osborns bitterhed over sin fars død og hans voksende vendetta mod Spider-Man. Selv Peters elskede tante May (Rosemary Harris), som har fået det hårdt efter onkel Bens død, begynder at tvivle på sin nevø.